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生物實驗室那些小細節~

更新時間:2017-11-12      點擊次數:1450

平時在實驗室常聽到的一句話就是“今天某某試驗沒做好是為什么?今天某某試驗沒出結果是什么原因?今天某某試驗為什么會是這樣的呢?” 等等。

然后仔細一查找原因,往往是由于操作上面的不認真,或是一些小小的細節沒有注意到。以下是集各路朋網友的一些實戰經驗,在此與大家分享:

1. 跑page膠的時候

小電壓跑會避免高電壓產生的熱量爾導致的膠層變形。低電壓泳道會比大電壓泳道跑的直一些,且分離效果更高,有利于分子量相差不大的蛋白分離。

 

2. 提取質粒的時候

后一步的酒精揮發很關鍵,基本上是其后續的酶切反應的決定性因素。所以這一步盡量揮發長一點時間,是空調吹熱風,或是37度溫箱放長一點的時間,我試過室溫過夜,酶切很好。

 

3. 做WESTERN BLOT 的時候

大家往往會摸索一抗、二抗的濃度,封閉時間,曝光時間等等,而每次變換其中的一個條件就需要從新跑膠、轉膜,甚至重新提蛋白,這樣會浪費大量的時間。其實*沒有必要這樣。一次轉膜后,將PVDF膜晾干,裁減成小塊,保存起來,用的時候取出一塊,沒有任何影響。這對于摸索條件的戰友來說,節約了大量的時間。

 

4. 有關緩沖液和培養基配置

1)將緩沖液配方中的成分分別以10-100倍配成母液儲存,需要的時候只需將相應的母液混合,補加水稀釋即可。

2)配培養基時通常會忘記各成分的量,如配LB時的三個成分不記得到底哪個是5g,哪個要10個,因此可以在常用的試劑瓶的標簽上注明所需的量,如配LB時,在NaCl瓶外注明10g/L, yeast 5 g/L, tryton 10 g/L等,很方便,不需要每次配之前臨時翻書。

 

5. 有關PCR主反應液配置

在做克隆鑒定的時候經常需要在酶切鑒定前進行PCR鑒定,每次配置PCR反應液很繁瑣,可以將其配置類似kit的形式,按你需要的反應體系列表,然后放大100倍配置100×主反應液(100次反應),其中含buffer,Mg2+,dNTPs,但不含引物和Taq酶,然后可以10×分裝或一管儲存在-20度,在需要的時候拿出融開,然后按所需的PCR反應個數吸取相應的倍數,再補加相應反應倍數的Taq和引物,混勻后分裝,這樣做的好處如下:

1)可極大的節省寶貴的時間,可早點收工,看球;

2)避免每次反應加樣不均的可能;

3)大大減少PCR假陽性的產生。

 

6. 有關酶切反應液的配置

在做酶切時,也可以象PCR一樣配置主反應液,每次反應前先列好反應的體系,算好需要的反應數,然后按所需反應的體系按所需反應數放大,加入buffer、酶、水,質粒欄空缺,然后混合后按除質粒DNA的體積分裝,然后再在每管中加入相應體積的質粒DNA酶切,這樣做的好處如下,特別是當同時有10幾個陽性克隆需要鑒定時尤為明顯:

1)各反應成分均一;

2)可大大減少限制型內切酶的使用;

3)節省時間。

 

7. 有關SDS-PAGE:

1)可將SDS-PAGE的積層膠,分離膠預先配好大體積如100ml儲存在4度冰箱(注:10%AP,TEMED不加,切記!!!),每次配置時只需吸取相應體積的預制膠加入AP,TEMED即可,沒必要每次制膠時候翻分子克隆,特別方便,而且,這樣的預制膠可儲存半年以上,不失為偷懶的方法;更關鍵的是可大大減少與丙稀酰胺的接觸,因此大大減少中毒的機會。2)電泳時雖然小電泳分離效果要好一些,但2小時以上的等待的時間實在是痛苦,因此可以提高電泳至150V,但需要將整個電泳槽放在放滿冰水的臉盆里散熱,這樣跑出來的膠分離效果絲毫不比低電壓來的差,關鍵是時間大大節省,不需1h即可看結果了。

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